攻克技術難題 提高檢測質量——第三代基因測序技術和相關產品簡介

攻克技術難題 提高檢測質量——第三代基因測序技術和相關產品簡介

高通量測序技術（也稱為第二代測序技術）對于單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphism，SNP）或基因組的某個位置上的小片段序列（長度通常小于50bp）的插入或缺失（insertion-deletion，InDel）檢測較準確，但是對于較大的結構變異檢測卻非常困難。第三代測序技術以不需要PCR擴增和長讀長為標志，實現了對每一條DNA分子的單獨測序，因此也被稱為單分子測序技術。目前，已有長讀長測序的第三代測序平臺實現商業化，并廣泛應用于科研領域，且有望在不久的將來用于臨床，進一步提高基因組結構變異等相關疾病檢出率。

　　測序技術不斷升級

　　2008年，Helicos BioSciences公司推出了全球第一款單分子測序平臺HeliScope，但該產品的序列讀長較短，系統整體測序錯誤率較高。隨后，針對單分子的長讀長測序技術出現。目前，長讀長測序平臺是指單分子測序長度不低于KB級別的技術平臺。如今，已經實現商業化的長讀長測序平臺主要有Pacific Biosciences公司的單分子實時測序（single molecule realtime sequencing，SMRT）平臺和Oxford Nanopore Technologies公司的納米孔測序（Nanopore）平臺。

　　單分子實時測序平臺

　　Pacific Biosciences公司開發的第三代測序技術稱為SMRT，該技術建立在兩項重要發明的基礎之上，有效攻克了測序領域測序讀長短的重大難題。其中，零模波導孔（zero-mode waveguides，ZMWs）技術可使激發光被限定在單分子納米孔底部的一定范圍之內，有效過濾背景噪音；熒光基團通過結合在核苷酸的磷酸基團上，能夠幫助DNA聚合酶完成一個全天然的DNA鏈合成過程。

　　基于該原理的具體產品有PacBio Sequel測序儀、PacBio Sequel Ⅱ測序儀。PacBio Sequel測序儀是率先實現商業化應用的第三代測序技術產品，其突破了傳統短讀長測序的諸多技術瓶頸。PacBio Sequel Ⅱ測序儀是PacBio Sequel的升級款，可提供CLR Library和CCSlibrary（HIFI）兩種測序模式，其測序芯片上的導孔（ZMW）由100萬個增至800萬個，理論通量較PacBio Sequel測序儀提升了8倍。同時，CCS reads（測序片段）的單堿基準確度也有了較大提升，同一片段在測序4次后，準確度可達約99%。

　　納米孔單分子測序平臺

　　Nanopore是基于電信號測序的技術，原理是通過電場力驅動單鏈核酸分子穿過納米尺寸的蛋白孔道，不同的堿基在通過納米孔道時會產生不同阻斷程度和阻斷時間的電流信號，因此可根據電流信號識別每條核酸分子上的堿基信息，從而實現對單鏈核酸分子的測序。由于該測序技術的原理與其他平臺有較大差異，亦被稱為第3.5代或第四代測序技術。

　　Nanopore測序儀的具體產品種類較多，均為基于Nanopore芯片而搭建的平臺，大到由多個芯片陣列組成的PromehION、GridION系列測序儀，小到可以連接手機Type C接口、電腦USB接口的MnION系列便攜式測序儀。其中，PromethION是一款高通量、高樣本數的臺式系統，其具有48個測序芯片，每個芯片有多達3000個納米孔通道，總計達 14.4萬個納米孔通道?；谶@種模塊化設計，測序芯片既可單獨運行也可同時運行，尤其適用于大樣本量、具有龐大數據量的項目。

　　上述兩類第三代測序平臺均具有長讀長、無GC偏好性以及可直接檢測甲基化修飾等優點。相較而言，SMRT平臺無錯誤偏好，可通過增加數據糾錯以提高測序準確度；Nanopore平臺讀長更長，可達到Mb級別，其中MnION測序儀的尺寸如手機大小，較為便攜（詳見表）。

　　應用方向有待探索

　　目前，長讀長測序的第三代測序平臺已廣泛應用于復雜動植物基因組、微生物基因組、全長轉錄組、微生物群體研究及人類基因組變異檢測等領域的科研項目中，以解決上述領域中檢測技術的瓶頸問題。

　　在疾病檢測方面，第三代測序技術基于其單分子檢測與長讀長測序的特點，在基因組結構變異檢測、短串聯重復序列（微衛星DNA）分析、單體型分析、真假基因區分、甲基化檢測等方面具有獨特的優勢。盡管目前許多基于第二代測序技術的基因診斷產品已基本成熟，但因高通量測序技術存在讀長短、對基因組覆蓋不均勻等局限，對SNP和InDel s檢測尚可，但對復雜結構變異的檢測卻無能為力。而第三代測序技術憑借長讀長、不需要PCR擴增、無GC偏好性等優勢，在用于腫瘤、遺傳病等基因檢測時，能夠進行長片段序列（長度通常大于50bp）測定，可以檢測缺失、重復、倒位、易位等結構變異，進一步提高了疾病的檢出率，有效彌補了第二代測序技術對結構變異檢測的不足。

　　相較于第二代測序平臺，第三代測序平臺大幅提升了序列讀長，但由于其錯誤率、成本及對樣本要求都較高，算法、軟件、數據庫等配套技術仍需進一步研究，目前該平臺仍處于科研項目應用階段。針對上述問題，各平臺正不斷優化升級相關技術，如PacBio測序儀的HIFI技術模式可有效提高數據準確度，Nanopore平臺也通過對Promet hION進行設備升級以進一步提高檢測準確度。相信隨著第三代測序平臺的不斷發展，其未來在醫學領域實現轉化應用后，將有效彌補目前針對基因組結構變異等相關疾病檢測手段的空白。（作者單位：國家藥品監督管理局醫療器械技術審評中心）